爱游戏,爱游戏体育,爱游戏平台,爱游戏娱乐,爱游戏官网,爱游戏官方网站,爱游戏豪礼,ayx爱游戏,爱游戏娱乐网,爱游戏app,爱游戏app体育,爱游戏AYX官方网站,爱游戏app官网,爱游戏官方网站青虾，学名日本沼虾MACROBRACHIUMNIPPONENSE，是我国重要的淡水养殖经济虾类。其在分类上属于节肢动物门ARTHROPODA，甲壳纲CRUSTACEA，十足目DECAPODA，长臂虾科PALAEMONIDAE、沼虾属MACROBRACHIUM。近年来，随着青虾遗传育种工作的开展，已有大量与性别和生殖相关的基因被克隆并进行了表达分析，但是对于这些基因的功能研究仍缺少有效的手段。RNA干扰RNAINTERFERENCE，RNAI技术是一种重要的基因功能研究手段，已在多种甲壳动物功能基因的研究中应用，然而该技术在青虾研究工作中的应用还鲜有报道。在青虾中建立RNAI的方法，将为青虾基因功能的研究开辟一条新的路径。本研究用实验室已克隆的青虾TRANSFORMER2MNTRA2基因进行青虾RNAI技术的研究，然后将RNAI技术应用到新克隆的青虾蜕皮抑制激素MOLTINHIBITINGHORMONE，MIH基因的功能研究中。在MNTRA2基因中研究了RNAI的最佳注射部位、注射剂量以及干扰规律。通过对肌肉、心脏、围心腔和眼柄基部四个注射部位的比较，确定围心腔为最适宜注射部位。采用该方法进行时间依赖性实验和不同剂量04ΜG/G、4ΜG/G和12ΜG/G干扰规律的实验。利用荧光定量PCRQRTPCR检测干扰后TRA2基因MRNA表达量的变化。时间依赖性实验表明RNAI效果会随着时间的变化而变化。04ΜG/G的注射剂量不能起到干扰效果，4ΜG/G和12ΜG/G的剂量干扰效果显著，均能使目的基因的表达量下降80％左右，TRA2MRNA的表达量均呈现先下降后恢复的规律。4ΜG/G的注射剂量在第7天使目的基因的表达量降为最低，14天基本恢复到和对照组持平。12ΜG/G的剂量在第5天使目的基因的表达量降为最低，干扰效果持续时间更长，在第14天时表达量恢复到对照组的60％。采用快速扩增CDNA末端RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE技术克隆了青虾MIH基因的全长CDNA序列。青虾MIH基因CDNA序列全长925BP，开放阅读框ORE为360BP，共编码119个氨基酸多肽前体，由信号肽41个氨基酸和成熟肽78个氨基酸组成。青虾MIH的氨基酸序列比对分析表明其与罗氏沼虾MACROBRACHIUMROSENBERGII和普通黄道蟹CANCERPAGURUS的相似性均达到90％以上。系统进化树分析表明，青虾MIH基因的氨基酸序列与淡水蟹类的遗传距离较近。采用QRTPCR技术分析了青虾MIH基因的时空表达。结果表明，MNMIH基因在卵裂期的表达量高，随后下降，潘状幼体期随着眼点的发育的MNMIH基因表达量升高，在出膜第一天达到一个表达高峰。幼体期表达量最低，幼虾期随蜕皮周期出现规律性的波动。青虾MIH基因在眼柄、腹神经、精巢、肌肉、鳃、心脏、脑、卵巢、肝脏9种组织中的表达结果显示，青虾MIH基因在眼柄中的表达量最高，其次是腹神经节、鳃、卵巢和脑，在其余组织中表达量极低或不表达。蜕皮周期中MIH基因表达量的变化检测结果表明，MIH基因在蜕皮前表达量下降到最低，蜕皮后表达量迅速上升，蜕皮间期维持高表达。根据已建立的RNAI技术用4ΜG/G的剂量，围心腔注射法对青虾MIH基因功能进行研究。QRTPCR检测结果表明实验组MRNA的表达量的变化规律和TRA2基因相同，均呈现先下降后恢复的趋势。也在第6～8天下降到最低水平，降低92％P＜005，与TRA2基因相比干扰效果更显著。连续性干扰实验在冬季进行，将同期发育的青虾分为四组雄虾干扰组和对照组雌虾干扰组和对照组。用4ΜG/G注射剂量，每7天对各组虾进行一次补充注射，记录6周内各组虾的蜕皮频次和体重变化。结果表明，RNAI能显著增加青虾的蜕皮频次，干扰雄虾和雌虾分别蜕皮17次、12次，而对照组雄、雌虾则为2次、5次。实验后雄虾干扰组的体重比实验前增加了026GP＜005，雄虾对照组、雌虾干扰组和对照组的体重分别增加了006G、008G和004G，与实验前相比增重不显著P＞005）。本研究首次在青虾中较系统地研究了RNAI的方法，并确定了干扰后的变化规律。首次克隆获得了青虾MIH基因的全长CDNA序列，并对其在不同发育时期、不同组织以及蜕皮周期中进行了时空表达分析。并将RNAI方法应用到青虾MIH基因的功能研究中，证明了该基因在青虾中能起到显著抑制蜕皮的作用，为甲壳动物蜕皮机制的研究提供了基础资料。同时为青虾基因功能的研究提供了有效手段。